对ATCC细胞培养时的试剂有何要求？

　　ATCC细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

　　ATCC细胞的培养试剂分析：

　　一、纺锤体阻断剂

　　在有丝分裂过程中，随着纺锤丝的形成，染色体被牵引到一起难以观察其形态。纺锤体的形成在于细胞质和纺锤体成分的粘度之间的平衡，因此，改变细胞质的粘度，即可破坏纺锤体形成，从而使得染色体均匀散开，且染色体缢痕区更为清楚。

　　在培养中使用的纺锤体阻断剂为秋水仙素，在终止培养前加入适量秋水仙素，使正在分裂的细胞停留在中期，以获得大量分裂相供分析之用。秋水仙素的浓度范围比较宽，一般使用浓度0.05-0.8微克/毫升，在终止培养前处理2-4小时。但在实际工作中需要借助浓度和处理时间来控制染色体的收缩程度。秋水仙素作用时间越长，被阻断的中期分裂相越多，但是染色体也越凝聚和收缩，所以还视各实验室经验而定。

　　二、ATCC细胞低渗液

　　低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，如水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65M）、KCl（0.075M）等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。实验室中一般选用0.075MKCl为低渗液（具体情况取决于实际操作，鉴于实验的连续性和稳定性，本实验室采用0.35%KCl），其优点有：

　　1.染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。

　　2.用于显带染色时能充分显示带型特点。低渗处理为37℃，15-25分钟，以预实验条件为准。

　　三、固定液

　　固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混和的固定液。

　　Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15分钟至24小时，冰箱、室温均可。必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。

　　四、滴片

　　滴片使细胞悬液从一定高处落在载玻片上，淋巴母细胞膜破裂，染色体分散开。载玻片可用冰片和干片，效果均好。滴片后需空气干燥。

　　五、Giemsa染色

　　Giemsa染料不是一种单一染料，而是天青、伊红、甘油和甲醇的混合物，配制后原液储存。在常规染色中，并不比其他染料优越，但在显带技术中，却是*的。

　　Giemsa工作液在使用前临时配制，浓度可在2.5-10%之间（原液2份加pH7.4磷酸缓冲液10-40份）。染色后，染色质呈红色，细胞核是蓝色。

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