【连载-企业参考品】肺癌PCR和NGS参考品的选择

科佰生物作为一家提供企业核酸诊断标准品的企业，在该领域已经深耕多年，与全国该领域90%的企业都有过合作，成功支持过很多企业的试剂盒研发和获批，在该领域有丰富的经验。根据我们对市场的调研，对客户需求的理解，我们把我们的产品线划分为多个模块，主要为支持PCR的单点mutation、fusion和CNV产品，支持NGS的小panel和大panel(泛肿瘤、包含TMB和MSI)产品，支持IHC和Fish的FFPE block产品，支持标准品定标的dPCR检测试剂盒产品等。

接下来的几期，我们陆续会针对不用的肿瘤，遵循NCCN指南的标注，为大家分享我们对企业参考品选择的看法。

肺癌（Lung cancer）是恶性的肺部肿瘤，肇因于肺部组织细胞不受控制地生长。如不治疗，肿瘤细胞会转移至邻近组织或身体的其他地方。肺部常见的原发性恶性肿瘤属于上皮癌，可粗分为小细胞癌（SCLC）和非小细胞癌（NSCLC）。根据《2018年癌症统计数据》显示：

1. 2018年将有大约1810万癌症新发病例和960万癌症死亡病例。

2. 肺癌依旧是发病率（11.6%）和死亡率（18.4%）较高的恶性肿瘤。发病率其次为女性乳腺癌（11.6%）、前列腺癌（7.1%）、结直肠癌（6.1%）；死亡比例其次为结直肠癌（9.2%）、胃癌（8.2%）、肝癌（8.2%）。 

从中国来看，肺癌是发病率（女性为乳腺癌较高）和死亡率较高的癌癌种。

肺癌的治疗一般分为外科治疗、放疗、化疗和免疫治疗，针对化疗和免疫治疗，临床已经有很多靶向药物，包含小分子和大分子药物，出于精准诊疗的原则，治疗前分子与生物标志物的分析尤为重要，针对肺癌的分子标志物主要包含EGFR，ALK，ROS1,BRAF,KRAS,MET,RET,ERBB2,PD1/PDL1,TMB(TMB是一个可能有助于选择适于免疫治疗患者的新型生物标志物，目前尚无测量TMB的共识)，各个分子标志物的临床意义和指导，请点击下载NCCN指南。因此围绕这些基因的诊断对肺癌的治疗有着非常重要的作用，被广泛应用于临床。

自然而然，国内外针对肺癌开发的诊断试剂盒是热门的，也是比较成熟的，甚至可以说作为肿瘤领域诊断公司的一张入场券，不管是已经获批的，还是正在申报的，甚至刚开始研发的，大家都在这个领域摩拳擦掌，准备大干一番。

围绕肺癌诊疗相关的EGFR,ALK，ROS1,BRAF,KRAS,MET,RET,ERBB2,PD1/PDL1,TMB(TMB是一个可能有助于选择适于免疫治疗患者的新型生物标志物，目前尚无测量TMB的共识)，我们依次分析各个基因在诊疗中的选择。

分子标志物：EGFR

➢表皮生长因子受体(EGFR)基因突变: EGFR 是一种常见于上皮细胞表面的受体酪氨酸激酶，在多种人类恶性肿瘤中往往呈过表达。

EGFR中常见的突变(外显子19缺失,外显子21中p.L858R点突变)与EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗的应答情况相关;近期的资料表明未携带EGFR敏感突变的肿瘤不应在任何时段的治疗中接受EGFR TKI的治疗。

²一些少见的EGFR突变,这类突变累计占到EGFR突变非小细胞肺癌的近10% (例如，外显子19插入，p.L861Q、 p.G719X、p.S768I) 也与EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI) 治疗的应答情况相关，但所研究的患者数目较少。

²一些EGFR突变与EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI) 治疗的应答情况缺乏相关性，包括大多数EGFR外显子20插入，以及p.T790M。

-大多数EGFR外显子20插入突变预示着对临床可达到的酪氨酸激酶抑制剂治疗(TKI) 水平的抵抗(耐药)。

-例外情况是一种罕见的EGFR外显子20插入变异型，p.A763_ Y764insFQEA,其与EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI) 治疗的应答情况相关。因此,对EGFR外显子20插入的认识必须建立在特定基因序列变异的基础上。

-与EGFR TKI初始治疗后疾病复发常见的相关发现是p.T790M突变,这是已知的耐药机制。如果在TKI暴露前发现该突变,则应考虑行遗传咨询，因为种系p.T790M突变与家族性肺癌易感性有关，故需要额外的检测。

²随着高通量测序(NGS)检测使用的增加，其它EGFR变异型的检出率也在增高;但是，个体变异的临床意义不易明确。

²某些临床病理特征——诸如吸烟情况、 种族和组织学特征——均与某种EGFR突变的存在情况相关;不过，这些特征不应用于选择接受检测的患者。

²检测方法:实时聚合酶链反应(PCR)、 桑格(Sanger)测序法(配合肿瘤富集操作)，以及高通量测序法(NGS) 是检测EGFR突变状态的常用的方法。

分子标志物：ALK

➢简变性淋巴瘤激酶(ALK) 基因重排: ALK 是非小细胞肺癌中一种可被重排的受体酪氨酸激酶，重排导致通过ALK激酶结构域的信号转导失调和异常。

²ALK常见的融合对象是棘皮动物微管相关样蛋白4 (EML4),但其它多种融合对象也已经被发现。

²ALK重排的存在与对ALK酪氨酸激酶抑制剂治疗(TKI)的应答情况相关,近期研究显示在一线治疗中阿来替尼(Alectinib) 比克唑替尼(Crizotinib) 的疗效更佳。

²某些临床病理特征——诸如吸烟情况和组织学特征已被证实与某种ALK重排的存在情况相关;不过，这些特征不应用于选择接受检测的患者。

²检测方法:荧光原位杂交(FISH)分离探针法是一个广泛使用的方法。免疫组化法可作为一种有效的筛查手段使用。经FDA批准的免疫组化法(ALK[D5F3]CDx检测)可单独使用，无需经FISH确认结果，但鼓励对结果行二次确认。多种高通量测序(NGS)法可检测ALK融合突变,而有时会用到靶向实时多聚酶链反应(PCR)检测,不过它们均不太可能检出带有新的融合对象的突变。

分子标志物：ROS1

➢ROS1 (ROS原癌基因1)基因重排: ROS1是非小细胞肺癌中一种可被重排的受体酪氨酸激酶,重排导致通过ROS1激酶结构域的信号转导失调和异常。

²发现的ROS1融合对象有多种，常见的融合对象包括: CD74、 SLC34A2、 CCDC6 和FIG。

²ROS1重排的存在与口服ROS1酪氨酸激酶抑制剂(TKI)疗效相关。

²某些临床病理特征——诸如吸烟情况和组织学特征——已被证实与某种ROS1 重排的存在情况相关:不过，这些特征不应用于选择接受检测的患者。

²检测方法:荧光原位杂交(FISH)分离探针法可以使用:不过,其可能无法检测FIG-ROS1变异型。免疫组化法(IHC)可以使用;不过,针对ROS1融合突变的IHC检测敏感性低，而随访验证性检验是作为一种筛查手段使用的ROS1 IHC法*的一部分。多种高通量测序(NGS)法可检测ROS1融合突变,而有时会用到靶向实时多聚酶链反应(PCR) 检测，不过它们均不太可能检出带有新的融合对象的突变(这样会导致无法检出ROS1融合事件)。

分子标志物：BRAF

➢BRAF (B-Raf原癌基因)点突变：BRAF是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,属于经典的MAP/ERK信号通路的一部分。BRAF突变激活导致通过MAP/ERK路径信号转导失调。

²BRAF突变可见于非小细胞肺癌。导致氨基酸位点600发生变化(p.V600E)的某种特定突变的存在已被证实与口服型BRAF和MEK抑制剂联合治疗的效果(应答情况)相关。

²注意其它BRAF突变已在非小细胞肺癌中被观察到，而目前这些突变对于治疗选择的影响尚未明确。

²检测方法:实时聚合酶链反应(PCR)、桑格(Sanger) 测序法(配合肿瘤富集操作)，以及高通测序法(NGS)是检测BRAF突变状态的常用的方法。尽管一种抗-BRAF p.V600E-特异性单克隆抗体已投入商用，而且一些研究已经测评了该方法的应用情况，但只有在大规模验证后才应该使用该方法。

分子标志物：KRAS

➢KRAS (KRAS原癌基因)点突变: KRAS是一种具有内在GTP酶活性的G蛋白，而激活突变导致通过MAP/ERK路径信号转导失调。

²KRAS突变常见于密码子12,但其它突变类型也可在非小细胞肺癌中见到。

²当与无KRAS突变的肿瘤患者相比，KRAS突变的存在预示生存不良。

²KRAS 突变已被证实与EGFR TKI治疗的效果(应答情况)降低相关。

²由于变异靶点的重叠可能性小，故KRAS突变的存在可能表明患者将不会从进一步的分子检测中获益。

分子标志物：其他

·靶向治疗中疾病进展时的检测:

➢受惠于上文列举的多个检测项，对治疗耐药的分子机制的认识也随之增加。当靶向治疗中疾病活动性进展时，对标本重新检测可为下一步治疗提供线索:

²对于已经EGFR TKI治疗，携带有潜在的EGFR敏感突变的患者，适宜的检测项目起码包括p.790M的高敏评估:当没有p.T790M存在证据时，针对替代性耐药机制(MET扩增、ERBB2扩增)的检测可被用来指导患者的其它治疗。p.T790M 的存在可指示患者接受第三代EGFR TKI治疗。

-检测EGFR p.T790M的试验设计的分析敏度应至少达到5%等位基因分数。早期的敏感突变可被用作许多试验中的一种内部对照以确定如果作为亚克隆事件存在的话，p.T790M 是否处于检测范围内。

²对于已经ALK TKI治疗的携带有潜在ALK重排突变的患者,还不清楚发现特定的酪氨酸激酶结构域突变是否能确定合理的下一步治疗,但一些初步数据提示特定的酪氨酸激酶结构域突变能影响后续治疗。

其中涉及的基因有MET skiping、MET扩增、RET重排和ERBB2扩增。

分子标志物：panel

对于PCR的企业参考品，如上的位点基本全部满足了，那针对NGS的panel型参考品，我们需要把重要的位点一起检测，这就要要求混样，混样有一定的原则，根据混样的原则和市场需求，我们开发了一些参考盘，具体如下：

综上，按照NCCN的指南，按照临床的药物，按照伴随诊断的需求，科佰生物开发了针对肺癌PCR的单点参考品、标准品，针对肺癌NGS的panel型的参考品、标准品，满足不同客户的需求。

标准品选择好了，接下来就是做性能评价，让我们先学习下指导原则，对于性能评价的规定。详见《从《指导原则》中分析参考品盘设计》。