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CD74-ROS1的药靶模型+DNARNA标准品+ddPCR试剂盒

原载自:www.co-bioer.com[技术资料频道]  2022-07-18  浏览次数:590

ROS原癌基因 1 (ROS1) 由位于染色体6q22.1的ROS1基因编码,属于酪氨酸激酶胰岛素受体亚家族,于1986年在涉及肌肉瘤RNA UR2肿瘤病毒的研究中被发现。ROS1的生理作用仍存在争议;其表达主要在肺组织中观察到,其次是宫颈和结肠。可以想象,酪氨酸激酶胰岛素受体在胚胎发育中起着关键作用。ROS1蛋白显示出与ALK(均属于胰岛素受体超家族)的大量同源性,特别是在ATP结合位点(84% 同源性)和激酶域(64% 同源性)。ROS1的融合突变,通常会导致与几个融合伙伴的基因融合,由此产生的融合蛋白是强大的致癌驱动因素。因此,ROS1激酶活性被持续激活,由于JAK/STAT、PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路的上调,导致细胞增殖、存活和迁移增加。ROS1已在体外和体内显示出致瘤潜力,胶质母细胞瘤是第一个显示出具有 ROS1重排的人类癌症。随后在其他恶性肿瘤中观察到ROS1融合,包括 NSCLC、黑色素瘤和偶尔的胆管癌、血管肉瘤、卵巢癌、胃癌和结直肠癌。ROS1改变既不能遗传也不能作为基因改变获得。


ROS1的重排约占NSCLC患者的2%,在NSCLC中常见的融合伙伴如下表所示,其中占比最高的是CD74基因。

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Table 1. Main ROS1 fusion partners in non-small cell lung cancer (NSCLC).


CD74位于染色体5q33.1,该基因编码的蛋白质与II类主要组织相容性复合体 (MHC) 相关,是调节免疫反应抗原呈递的重要分子伴侣。它还充当细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子 (MIF) 的细胞表面受体,当其与编码的蛋白质结合时,会启动存活途径和细胞增殖。这种蛋白质还与淀粉样前体蛋白 (APP) 相互作用并抑制淀粉样蛋白 β (Abeta) 的产生。


在非小细胞肺癌的诊断中,NCCN指南明确描述“ROS1 is a receptor tyrosine kinase that can be rearranged in NSCLC, resulting in dysregulation and inappropriate signaling through the ROS1 kinase domain."强调了ROS1的分子诊断的意义,是必须要检测的一个分子marker,同时推荐的检测方法描述为“FISH break-apart probe methodology can be deployed; however, it may under-detect the FIG-ROS1 variant. IHC approaches can be deployed; however, IHC for ROS1 fusions has low specificity, and follow-up confirmatory testing is a necessary component of utilizing ROS1 IHC as a screening modality. Numerous NGS methodologies can detect ROS1 fusions, although DNA-based NGS may under-detect ROS1 fusions. Targeted real-time PCR assays are utilized in some settings, although they are unlikely to detect fusions with novel partners."


全套合集之一:药靶模型

CD74-ROS1融合蛋白,可以组成型激活细胞增殖,选择在依赖IL3的BaF3细胞模型上,外源过表达CD74-ROS1蛋白,可以作为驱动基因,驱动Baf3细胞的增殖,而不需要IL3,因此可以用于针对CD74-ROS1的抑制剂的活性检测。基于以上的原理,科佰生物开发了CD74-ROS1/Baf3药靶模型,可以在In vitro层面检测样本的抑制活性,同样也可以在in vivo层面做CDX模型,检测药物的活性。

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Fig 1. Sanger sequencing of CD74-ROS1/BaF3(CBP73331),左侧为CD74基因,右侧为ROS1基因。


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Fig 2. Cell-based kinase assay of CD74-ROS1/BaF3(CBP73331),不同阳性药物对CD47-ROS1细胞增殖抑制的活性比较。


全套合集之二:DNA标准品

我们知道CD74位于5号染色体上,ROS1位于6号染色体上,CD74-ROS1融合是一种易位融合,常见的CD74(E6)-ROS1(E34)在临床病人的DNA测序上,CD74的断点是在6号内含子上,ROS1的断点是在33号内含子上,而且不同的病例,断点不止一个,因此基于CD74-ROS1在DNA层面的标准品,首先肯定断点在内含子上,其次一种标准品仅代表一种断点。基于以上信息,科佰生物通过基因编辑技术开发定制了一款DNA层面的CD74(E6)-ROS1(E34),通过sanger测序、ddPCR检测对DNA做定标,发布一款DNA标准品。


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Fig 3. Sanger sequencing of CD74-ROS1 Translocation(CBP20177D),左侧为CD74基因,右侧为ROS1基因,断点为内含子断点。

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Fig 4.ddPCR of CD74-ROS1 Translocation(CBP20177D),检测显示该标准品突变频率为50%。


全套合集之三:RNA标准品

CD74-ROS1融合在病理上有意义,主要是因为融合蛋白的活性,也就是说,假设DNA层面出现融合,但是没有RNA,进而没有蛋白,其实也没有任何意义的,因此针对CD74-ROS1的RNA的检测,会更有意义。科佰生物通过基因重组的技术,在RNA层面定制出CD74(E6)-ROS1(E34)的细胞模型,再通过sanger测序,ddPCR检测对RNA做定标,发布一款RNA标准品。


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Fig 5. Sanger sequencing of CD74-ROS1 Fusion(CBP20170R),左侧为CD74基因,右侧为ROS1基因,断点为外显子断点。

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Fig 6. DdPCR of CD74-ROS1 Fusion(CBP20170R),检测显示该标准品拷贝数为2244.5copies/ng。



全套合集之四:ddPCR试剂盒

不管是针对CD74-ROS1融合的药物研发,还是诊断,在各种应用检测中,都少不了PCR的检测技术,比如在药靶模型的构建中,我们可以使用PCR的技术看外源基因是否过表达,看阳性比例,筛选克隆,方法学优化等等,比如在诊断中,可以筛选阳性病人,性能评价,平时的质控等等。在PCR技术中,ddPCR是一种灵敏度高的绝对定量的一种方法,比起Q-PCR,灵敏度高,不需要做标准曲线,比起NGS,成本低,周期短,能快递出结果。科佰生物开发了针对DNA和RNA的ddPCR检测试剂盒,适用于在药物研发和临床诊断中的检测。


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Fig 7. 针对CD74-ROS1的DNA层面ddPCR性能评价,使用标准品稀释到不同的%AF,在不同的%AF下显示准确的检测能力。

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Fig 8. 针对CD74-ROS1的RNA层面ddPCR性能评价,使用标准品稀释到不同的拷贝数,在不同的拷贝数下显示准确的检测能力(注意RNA需要反转录为cDNA检测,反转录需要在*相同的体系下开展)。


 

 

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