【基因编辑产品新品上市】MET Ex14 skipping新添成员

MET基因位于人类基因组的7q31号染色体上，跨越约125kbDNA，包含21个外显子和20个内含子。MET被编码为前体，通过其a和b亚基之间的蛋白水解切割被修饰成成熟蛋白质。 成熟的MET蛋白由一个小的a亚基(50kDa)和一个较大的b  (145kDa)亚基组成，通过二硫键连接在一起。一个a亚基和b亚基的一部分共同构成异二聚体蛋白的胞外区，而b亚基的其余部分构成跨膜区和胞内区。

MET的细胞外成分包含三个结构域。N端Sema(Sema-phorin)是最大的结构域，包含500个残基，包含a和b亚基的一部分。该结构域对于MET的配体结合、二聚化和激活至关重要。Sema结构域之后是丛蛋白-信号蛋白-整合素(PSI)结构域，包含四个二硫键，这对于配体结合受体的正确定位至关重要。PSI结构域通过免疫球蛋白-丛蛋白-转录因子结构域连接到MET的跨膜螺旋。受体的细胞内部分包括近膜(JM)结构域、酪氨酸激酶(TK)催化结构域和C末端多功能停靠位点。其配体肝细胞生长因子(HGF)（也称为分散因子）的结合对于激活激酶活性至关重要。HGF是迄今为止已知的MET受体配体，并以高亲和力与受体结合。

Fig1.MET蛋白的结构

HGF与MET结合导致受体二聚化，导致激酶结构域中细胞内残基Y1234和Y1235自磷酸化，随后在激酶结构域外的C端磷酸化另外两个酪氨酸残基Y1349和Y1356。C末端残基的磷酸化导致对接位点的形成，随后衔接子和效应蛋白，如GRB2（生长因子受体结合蛋白2）、GAB1（GRB2相关结合蛋白1）和SHC（含Src同源2结构域），与停靠位点结合，触发下游信号传导。

2005年报道了NSCLC中MET Ex14的跳跃 。内含子13的3' 剪接位点或内含子14的5 '末端剪接位点的替换或缺失导致MET Ex14跳跃。在MET Ex14的剪接点处或剪接点附近发生的这种体细胞改变导致转录物中外显子14的丢失和MET蛋白的合成以及JM结构域中47个氨基酸的框内缺失（包括残基Y1003)消融CBL介导的受体泛素化和降解。因此，MET Ex14跳跃导致MET蛋白水平升高，这可以驱动促进肿瘤发展的下游信号通路的激活。

Fig 2. MET Ex14跳跃的机理

根据文献报告，在非小细胞肺癌中常见的导致MET Ex14跳跃的突变有如下几种：

Fig 3. 常见导致MET Ex14跳跃的突变

同时在众多的其他癌种中也发现很多，大约 3–4% 的 NSCLC 具有MET Ex14改变。在组织学亚型中，  MET Ex14跳跃改变常见于肉瘤样癌 (4.9–31%)，69–72腺鳞癌 (4–8%)、腺癌 (3–4%) 和鳞状细胞癌 (2%)。此外，在腺癌中，主要的亚型是腺泡型 (35-52.9%) 或实性亚型 (35.3-53%)。临床上，  METEx14跳跃异常多见于高龄患者。

一般而言，基于DNA和RNA的分子检测是检测METex14改变的方法。基于DNA的测序分析可以检测MET改变，例如剪接位点的插入、缺失、点突变或重复，这些改变可能导致外显子14跳跃。然而，METEx14跳跃与剪接位点中超过120个报告的序列变异有关，这使得仅使用基于DNA的检测来检测这些突变具有挑战性。因此，对RNA转录本的分析可以验证外显子13和15之间的融合。在理想情况下，基于DNA和RNA的检测可相互补充，以可靠地检测METEx14改变。

Fig 4. 常见针对DNA和RNA检测技术来识别MET Ex14跳跃的方法

科佰生物利用基因编辑的方法，成功获得多种MET Ex14跳跃的标准品，表现为在DNA层面出现剪切变异，在RNA层面出现14外显子的缺失，部分产品罗列如下：

表1. 部分MET Ex14跳跃突变的产品

检测数据如下（以c.3028+1_c.3028+9del为例）

AI-Edigene® MET Splice Site Mutation（c.3028+1_c.3028+9del）Reference Standard

Fig 5. DNA的sanger测序显示c.3028+1_c.3028+9del

Fig 6. RNA的sanger测序发生14外显子的缺失

Fig 7. DNA的ddPCR检测，显示突变频率为*

Fig 8. RNA的ddPCR检测，显示拷贝数为1315.07 copies/ng

如上数据可知，不仅仅在DNA层面发生了剪切变异，在RNA层面也发生了变异，而且根据ddPCR的拷贝数数据显示，MET表达也大大增加了。

科佰生物在使用基因编辑技术定制定点突变、插入、缺失、融合上有丰富的经验，欢迎大家一起沟通讨论。