DPCR检测试剂盒开发性能验证

科佰生物

科佰生物针对以上应用开发对应的检测试剂盒，配套科佰生物的参考品，对试剂盒做性能评价，如下我们以EGFR T790M为例：

待测样本：20个阴性样本和1个NTC。分别将投入量设置为10ng和40ng，每个样本做两个重复进行Bio-Rad数字PCR检测。

由上数据可见：无论是10ng还是40ng，LOB控制在2拷贝以内（一般噪音拷贝为5以内），杂点不呈现剂量的依赖，是随机产生的噪音信号。

待测样本：10个NGS验证为阳性的样本（编号1-10）;  10个NGS验证为阴性的样本（编号11-20）。对20个样本分别使用数字PCR检测。

由上数据可见：

①测试10个NGS阳性样本,检测结果均为阳性，阳性符合率100%，并定量检出变异频率。

②测试10个NGS阴性样本,检测结果均为阴性，阴性符合率100%，定值变异频率均为0%。

1、投入量与拷贝数、频率之间的线性测试

首先选取50%突变频率的EGFR T790M标准品(CBP10402)，该标准品是通过基因编辑，二等位基因，CN=2，编辑一条为mutation，一条为WT，经过理论值计算、Sanger测序、Bio-Rad DdPCR试剂盒（Assay ID: dHsaCP2000019）共同验证，确认为50%的频率。

1.1 投入量在0.1ng~200ng间设置10个梯度，进行数字PCR检测（2复孔），分别考量FAM拷贝数与投入量是否线性相关、VIC拷贝数与投入量是否线性相关；

1.2 投入量在0.1ng~200ng间设置10个梯度，进行数字PCR检测（2复孔），判断是否满足%AF=50±10%波动。

由上数据可见：

①200 ng投入量过大，拷贝数不呈现线性，虽然满足45-55%范围，但是不适合做单一通道的拷贝数判定；

②0.1 ng投入量过小，拷贝数不呈现线性，同时42.59%也低于45%，不适合做单一通道，也不适合做双通道；

因此：范围为0.5-100ng。

2、线性稀释不同频率理论值与检测值的线性测试

根据以上结论，我们选取10ng作为进一步的%AF线性范围探索，首先使用EGFR T790M的对应的阴性标准品，对50%的标准品进行有限稀释，0.1%-50%间设置9个AF梯度，进行数字PCR检测（2复孔）。

由上数据可见：在10ng的投入量下，AF%呈现非常好的线性稀释，存在波动，但是都在误差范围内。

我们可以通过理论计算来预测下可能的检测限范围。当控制拷贝在15000（对应50ng input）以内时LOB数据是2，2/15000=0.0133%，预测检测限为0.0200%。

在如此低频的情况下，临床适用场景适合ctDNA，一般来说临床上10ml全血，一般中位值ctDNA是20-40ng，取低值20ng。20ng 理论值6000个拷贝数，2/6000=0.0333%，预测检测限为0.0500%。

0.05%的误差范围是±50%，就是0.025-0.075%，因此我们选择3个点，探寻LOD分别为 0.010%、0.050%、0.100%，要求95%检出。

0.010%  

对20个0.01%的样本进行数字PCR检测，观察在0.005-0.015%以内是否达成95%检出。

0.05%  

对20个0.05%的样本进行数字PCR检测，观察在0.025-0.075%以内是否达成95%检出。

0.1%  

对20个0.1%的样本进行数字PCR检测，观察在0.05-0.15%以内是否达成95%检出。

由上数据可见：选择0.05%作为该检测试剂盒的检测限LOD。

选取强阳性2%样本20个，中阳性1%样本20个，弱阳性0.2%样本20个分别进行数字PCR检测。

由上数据可见：强阳性2% 、中阳性1% 、弱阳性0.2%三种检测体系下，误差均在合理的范围内，精密度良好。

首先使用EGFR T790M的对应的阴性标准品，对50%的标准品进行有限稀释，每个梯度使用阴性样本两倍稀释，接着对11个样本进行检测。

由上数据可见：当AF在0.05%-50%范围内，对应的回收率在80-120%范围，符合预期。

取10个不同AF（1%~50%）的标准品样本，分别安排实验员A、实验员B在同一天，每人进行四次检测。

由上数据可见：EGFR T790M检测体系是稳定可重复的检出的。

取10个不同AF（1%~50%）的标准品样本，分别安排①实验员A、实验员B在同一天进行每人四次实验测试；②实验员A在第一天、第二天分别进行四次实验测试；③实验员A在第一天进行四次实验测试，实验员B在第二天进行四次实验测试。

由上数据可见：EGFR T790M检测体系是稳定可重复的在不同人、不同时间检出，重现的。